Der Schutz der biologischen Vielfalt umfasst die Erhaltung von Ökosystemen, Arten und der genetischen Vielfalt. Dazu gehört es, die Vielfalt der Stadtnatur zu sichern, wertvolle Lebensräume zu bewahren, Populationen der stadttypischen Arten zu unterstützen, Artenvielfalt und genetischen Austausch zu fördern. Zudem sollen über Prozessschutz natürliche Prozesse wie Sukzession gefördert werden, so dass sich standortangepasste urbane Ökosysteme entwickeln können. Handlungsmöglichkeiten sind dementsprechend:

Die Natur in der Stadt ist vielfältig und umfasst Relikte der ursprünglichen Naturlandschaft, kulturlandschaftlich genutzte Gebiete, gärtnerisch gestaltete Anlagen wie Parks und Gärten sowie die wilde Stadtnatur auf Brachen oder Ruderalflächen. Diese Vielfalt ist zu sichern und fördern. Es gilt, die Flächenkulisse und die räumliche Verteilung der Stadtnatur im Stadtgebiet zu erfassen (z.B. im Rahmen von Freiraumkonzepten oder Biodiversitätsstrategien) und das Freiraumsystem planerisch zu sichern (z.B. über die Flächennutzungsplanung). Gebiete mit hoher Biodiversität oder bedeutenden Ökosystemleistungen sind über die Ausweisung als Schutzgebiete oder Maßnahmen zu schützen. Darüber hinaus sollen Vorkommen gefährdeter Arten, Flächen mit einer hohen Lebensraumvielfalt, klimatische Ausgleichsräume oder natürliche Kohlenstoffspeicher erhalten werden. Diese Ökosysteme sind durch Schutzgebiets- und Biotopmanagement und nachhaltige Landnutzung zu erhalten.

Urbane Tier- und Pflanzenarten sind vielen Gefährdungen ausgesetzt. Daher ist es ein Ziel, heimische und regionaltypische Arten durch Schutz ihrer Lebensräume und spezifische Maßnahmen zu unterstützen, insbesondere stadttypische gefährdete Arten. Hierzu gehören auch gebäudebewohnende Arten und einst häufig vorkommende Siedlungsarten wie der Haussperling, die in ihren Beständen stark abnehmen und auf Nistmöglichkeiten an Gebäuden und lokale Nahrungshabitate angewiesen sind. Negative Auswirkungen durch Beleuchtung, Glasfassaden oder Lärm sind zu reduzieren. Für Arten, deren Vorkommen in Siedlungsräumen Konflikte verursachen (z. B. Biber in Parkanlagen, Füchse in Siedlungsgebieten), ein Wildtiermanagement mit entsprechendem Aufklärungs- und Vermittlungsauftrag einsetzen. Problematische ausbreitungsstarke Arten sollen nach Möglichkeit eingedämmt werden.

Die Stadtnatur ist geprägt von neuartigen Ökosystemen, für die es keine historische Entsprechung gibt. Die Gemeinschaften aus heimischen und nicht-heimischen Arten, die gut an extreme urbane Standortbedingungen angepasst sind und dabei Ökosystemleistungen und Lebenszyklen anderer Arten stützen, sollen als Bestandteil der Stadtnatur anerkannt und Raum für natürliche Entwicklungsprozesse gelassen werden. Spontan entstandene Wildnis- und Sukzessionsflächen sollen erhalten oder neu angelegt und behutsam für die Erholungsnutzung und Naturerleben geöffnet werden. Bei Vorkommen gefährdeter Arten oder zur Förderung bestimmter Biotope ist fachgerechte Pflege erforderlich.

Durch große Distanzen und Barrieren zwischen Lebensräumen besteht in urbanen Räumen geringer genetischer Austausch. Auch wenn Städte an sich reich an Pflanzenarten sind, ist beim gärtnerischen Grün eine Homogenisierung festzustellen. Bei Neupflanzungen von Bäumen werden in der Regel nur wenige Arten oder Sorten gewählt, die beispielsweise aktuell als besonders stadttauglich gelten. Um pflegeleichte und einheitliche Bestände zu erzeugen, sind auch andere gepflanzte Vegetationsbestände artenarm. Angepflanzte Vegetation weist durch Züchtung zudem eine geringe genetische Vielfalt auf. Krankheiten und Parasiten können solche einheitlichen Bestände vollständig befallen und vernichten. Die Arten- und Sortenvielfalt sollte besonders bei Stadtbäumen und durch lokal angepasste Arten gefördert werden. Bei Ansaaten kann Saatgut aus gebietseigenen Herkünften verwendet werden wie Region-Saatgut oder durch Heudrusch und Mahdgutübertragung gewonnen werden. Um eine resiliente Stadtnatur zu entwickeln, sollten der Biotopverbund gestärkt und Barrieren abgebaut werden.