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Transformationstechniken

Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation

Diese Technik baut auf einem natürlichen Übertragungssystem auf. Das Bakterium Agrobacterium tumefaciens verursacht Gallen und Tumore an Dikotyledonen (zweikeimblättrige Pflanzen), wenn die Bakterien über Verletzungen ins Pflanzengewebe eindringen können. Die Gene hierfür liegen in den Bakterien auf einer speziellen ringförmigen DNA, dem Ti(Tumor induzierenden)-Plasmid, das die T(Transfer)-DNA enthält. Bei einer Infektion gelangt die T-DNA in die Pflanzenzelle, wird ins Pflanzengenom integriert und veranlasst die Pflanze, Nährstoffe für die Bakterien zu produzieren.

Die Gentechnik nutzt dieses Vektorsystem und hat statt der tumorbildendenden und stoffwechselverändernden Gene Fremd-DNA, in der Regel Selektion- oder Markergene (zur Selektion der transformierten Pflanzen) sowie Zielgen plus regulatorische Sequenzen, einkloniert. Da viele Bearbeitungsschritte in dem Bakterium Escherichia coli erfolgen, ist ein weiteres Markergen (zur Selektion der transformierten Bakterien; in der Regel ist es ein Antibiotikaresistenzgen = ARG) erforderlich, das in das Rückgrat des Ti-Plasmids eingefügt wird. Die mit dem neuen Plasmid ausgestatteten Agrobakterien werden dann zusammen mit Blattgewebe kultiviert. Einzelne Pflanzenzellen werden die T-DNA aufnehmen und in ihre Erbanlagen integrieren. Anschließend werden die Bakterien entfernt und die transformierten Pflanzenzellen durch Phytohormone regeneriert. Der pflanzliche Marker und entsprechende Selektionsmedien gewährleisten, dass nur transformierte Pflanzenzellen überleben und zu ganzen Pflanzen regeneriert werden.

Ein definitives Modell, wie die T-DNA in das Pflanzengenom eingebaut wird, liegt bislang nicht vor. Umlagerungen und Deletionen der Fremd-DNA als auch der pflanzeneigenen DNA wurden bisher bei fast allen transgenen Pflanzen beobachtet.


Biolistische Transformation

Mit Ausnahme des Mais lassen sich Getreidearten und andere einkeimblättrige Pflanzen nicht durch Agrobakterien transformieren. Abhilfe präsentierten Sandford et al. (1987) mit der biolistischen Transformation, auch genannt particle gun oder Genkanone, bei der Fremd-DNA gebunden an Metallpartikel in die Zellen geschossen wird. Auch bei dieser Methode enthält die Fremd-DNA Regulationselemente, Zielgen und Markergen, meist ein ARG oder ein HR-Gen. Im Vergleich zur Agrobakterien-Transformation ist die Regeneration der Pflanzen hier einfacher, da die Zellwände nicht entfernt werden müssen. Auch eignet sich die Methode für Plasmide, lineare DNA sowie größere Gensequenzen. Da mehrere Geschosse eine Zelle treffen können, werden bei der biolistischen Transformation häufig mehrere (bis zu 20) Kopien an unterschiedlichen Stellen in das Genom eingebaut. Auch werden die Pflanzenzellen nur mit geringer Effizienz transformiert und die DNA im Zellkern nicht immer stabil integriert (transiente Genexpression). Bei der Integration großer Plasmide entstehen Bruchstücke, die an verschiedenen Stellen ins Pflanzengenom inseriert werden können. Die hohe Kopienzahl und die Entstehung von Bruchstücken erhöhen die Wahrscheinlichkeit, dass durch die biolistische Transformation unerwartete Effekte auftreten.


Bewertung

Für beide Transformationsmethoden gilt, dass Fremd-DNA an zufälligen Stellen in das Pflanzengenom integriert wird. Dadurch können pflanzeneigene Regulationsmechanismen verändert werden und es kann zu ungewollten Effekten kommen. Die Genregulation ist ein sehr komplexer Vorgang, der über verschiedene Mechanismen gesteuert wird. Die Regulationseinheiten liegen zum Teil weit entfernt von dem zu regulierenden Genabschnitt. Neu eingefügte DNA-Sequenzen können diese Regulationszusammenhänge verändern und stören. Untersuchungen haben gezeigt, dass bei der Übertragung der T-DNA regelmäßig auch Sequenzen aus dem Plasmidrückgrat mit übertragen werden und dass Agrobakterien zum Teil über mehrere Generationen weitergegeben werden. Daher sind auch die Gene des Plasmidrückgrats, wie z. B. die bakteriellen ARG, bei der Risikobewertung zu berücksichtigen. Weiterhin steht auch die Regeneration der Pflanzenzelle durch Phytohormone im Verdacht, Mutationen auszulösen.

Die gentechnischen Transformationsmethoden greifen in die Genregulation des Pflanzengenoms ein. Bei der klassischen Züchtung hingegen bleiben die Gene in der Regel in ihrem Regulationskomplex erhalten.

Letzte Änderung: 06.07.2006

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