Rote Listen dokumentieren den aktuellen Kenntnisstand, indem eine Bewertung der Gefährdungssituation aufgrund wissenschaftlicher Erkenntnisse vorgenommen wird. Die Rote-Liste-Einstufungen geben somit in komprimierter Form das Wissen einer großen Anzahl von Spezialisten aus den jeweiligen Sachgebieten und den Regionen wieder.
Darüber hinaus finden weitere verfügbare Quellen wie Literaturangaben, Kartierungsergebnisse und Sammlungsmaterialien Berücksichtigung. Sowohl die Anzahl der beteiligten Spezialisten (für die Rote Liste gefährdeter Pflanzen mehr als 100, für die Rote Liste gefährdeter Tiere ca. 450, für die Rote Liste Pflanzengesellschaften annähernd 100) als auch die Datengrundlage konnte seit Beginn der Aufstellung von Roten Listen in Deutschland kontinuierlich gesteigert bzw. verbessert werden.

Die Feldbeobachtungen zu Beständen von Tier- und Pflanzenarten sowie Pflanzengesellschaften von meist ehrenamtlichen Fachleuten (Botaniker, Zoologen, Ökologen) sind die Grundinformation für Rote Listen.
Diese Informationen werden z.T. in regionalen Verbänden oder Vereinen zusammengetragen und gesammelt, bevor sie an speziell eingerichtete Rote-Liste-Arbeitsgruppen oder an einzelne Koordinatoren der Roten Liste weitergegeben werden. Die Bearbeiterzahlen sind dabei gruppenspezifisch unterschiedlich.

Bei der Gefährdungseinstufung der Biotoptypen wurden vor allem auch die Kenntnisse der Kollegen der Landesanstalten und -ämter einbezogen. Die wesentliche Datengrundlage bildeten dabei die Ergebnisse der Biotopkartierungen der Bundesländer.

Darüber hinaus werden im großen Umfang historische Daten und Kartenwerke ausgewertet und aktuelle Verbreitungsübersichten einbezogen, wie sie z.B. im Rahmen der Berichtspflichten für die FFH-Richtlinie zusammengestellt werden (RIECKEN et al. 2006).

Die Arten der Flora und Fauna Deutschlands werden nach einem festgelegten Kriterienschlüssel nach dem Grad ihrer Gefährdung den Kategorien der Roten Liste zugeordnet. Der Kriterienkatalog berücksichtigt die verschiedenen Aspekte zur Bestandssituation in der Gegenwart, Vergangenheit und Zukunft, die schließlich zur Einstufung in die Kategorien der Roten Liste führen. Die Konkretisierung der Kriterienskala muss dabei aufgrund der stark unterschiedlichen biologischen Eigenschaften gruppenspezifisch vorgenommen werden (vgl. SCHNITTLER et al. 1994).

In Fällen mit nur kleinen Stichproben erfolgt i. d. R. eine Einstufung der gefährdeten Arten in die Kategorie G (vgl. SCHNITTLER & LUDWIG 1996).

Eine weitere Hilfe für die Gefährdungseinschätzung der Arten der bundesweiten Roten Liste waren die Rote-Liste-Einstufungen der Bundesländer. In den Arbeitsgruppen, die sich zu den jeweiligen systematischen Gruppen für Flora und Fauna bildeten, wurden schließlich die endgültigen Zuordnungen zu den Kategorien festgelegt.

Für die Gefährdungseinstufung bei der Roten Liste der Biotope kommt ein zweistufiges Kriteriensystem zum Einsatz. Neben den reinen Flächen- und Bestandsverlusten werden auch Qualitätsverluste beurteilt. Der jeweils in einem der Teilkriterien ermittelte höchste Gefährdungsgrad bildet dann auch den Wert für die regionale Gefährdung. Hintergrund dieses Ansatzes ist, dass viele Lebensräume auch schleichend degradieren, z. B. durch Eutrophierung oder Nutzungsintensivierung, und somit zunehmend ihre typische Ausprägung verlieren. Sie sind dann gefährdet, ohne dass Flächenverluste eintreten müssen. Erst wenn die Veränderungen so stark werden, dass ein Wechsel des Biotoptyps (z. B. von einem oligotrophen zu einem mesotrophen See) stattfindet, entstehen auch Flächen- und Bestandsverluste. Darüber hinaus wird in der Roten Liste der Biotope auch die typbezogene Regenerierbarkeit beurteilt. Sie soll einerseits bei der Bewertung der Ausgleichbarkeit von Eingriffen (gem. § 8 BNatSchG) Verwendung finden und andererseits Handlungsprioritäten bei gleichem Gefährdungsgrad aufzeigen (vgl. BLAB et al. 1993, RIECKEN et al. 2006).

Bei der Neubearbeitung der Roten Liste der Pflanzengesellschaften für ganz Deutschland wurden die Kategorien und Definitionen in Anlehnung an das Konzept von Schnittler et al. (1994) und an die Rote Liste gefährdeter Pflanzen Deutschlands (LUDWIG & SCHNITTLER 1996) erweitert und ergänzt. Neu aufgenommen wurden die Kategorien G (Gefährdung anzunehmen), R (extrem selten, anstatt "potentiell gefährdet"), V (zurückgehend, Gesellschaft der Vorwarnliste) und D (Daten mangelhaft).

Die Kriterien Bestands- und Flächenrückgang sowie Seltenheit, floristische Verarmung und Wandel in der Bestandesstruktur, Abnahme der Vielfalt an Ausbildungsformen sowie Flächengröße und Bestandstendenz, wurden nur bei der regionalen Bewertung durch die einzelnen Bearbeiter getrennt beurteilt, in der Gesamtbewertung der Gefährdung für die Bundesliste jedoch zu einer Gefährdungskategorie zusammengefasst.